前言
胚胎生產技術能通過減少世代間隔和提高選擇強度來促進遺傳發育，現已成功在牛繁殖領域進行商業應用，理論上最有效的方法是利用最好的供體牛生產大量的體外胚，進行活檢和冷凍并進行遺傳評估，然后將最令人滿意的基因型轉移給受體。在實際生產應用中，除了鮮胚移植還會涉及胚胎冷凍保存等環節，以便隨時隨地應用。但在移植冷凍胚胎后平均妊娠率往往會稍低于鮮胚移植時的平均妊娠率，進而導致一些優質胚胎的浪費。本研究的目的旨在評估在慢速冷凍前后同一供體荷斯坦母牛體內或體外生產的胚胎脂質組成及變化，進而為通過調節脂質成分提高胚胎對冷凍的耐受能力提供參考。
結果：
胚胎生產資料：通過OPU-IVF進行5次體外胚胎生產，通過沖洗子宮角進行3次體內胚胎收集，以產生研究所需的胚胎。用IVF和沖胚采集程序分別產生了95枚和78枚（Q1級)擴張囊胚（見表1A、B）。IVF過程中每個供體在體外產生的Q1囊胚的平均數量為2.1±0.3，體內胚胎期間每個供體為3.4±1.0。
牛胚胎的脂質組成: 使用超高壓液相色譜 (UHPLC) 獲得了87個Q1擴張囊胚的液相色譜高分辨率質譜(LC-HRMS)光譜，并確定了1686個特征。檢查數據后，在質量控制(QC)和同位素消除中消除變異系數 (CV)優于30%的離子，保留了496個特征。在這496個特征中，74個是使用SimLipid數據庫注釋的，注釋的脂質主要是甘油三酯 (32/74)，甘油二酯 (12/74)，甘油磷脂和溶血磷脂 (12/74)（補充表S1）。這87個Q1級囊胚中，43個由IVF獲得，44個由沖胚收集得。43個體外胚中提取了22個鮮胚的脂質（13個雄性和9個雌性胚胎），21個胚胎（8個雄性和13個雌性胚胎）先冷凍后再進行脂質提取。對于44個體外胚，提取了22個鮮胚的脂質（11個雄性和11個雌性胚胎），剩下22個胚胎（10個雄性和12個雌性胚胎）冷凍后進行脂質提取（圖1）。
實驗設計：八頭荷斯坦青年母牛通過OPU-IVF和體內胚胎收集程序生產體外和體內胚胎。受精7天后，對所有1級擴張囊胚進行活檢和性別鑒定。每組一半在新鮮狀態下進行脂質提取，另一半在進行脂質提取之前先冷凍。脂質提取物通過液相色譜-高分辨質譜分析并允許檢測496個特征。
體內或體外產生的鮮胚中的脂質質譜特征：為評估胚胎來源對其脂質譜的影響，使用了44個囊胚，包括22個體外胚和22個體內胚（圖1）。主成分分析(PCA)顯示體內（橙色點）和體外（藍色點）胚胎之間存在分離（圖2A）。正交偏最小二乘分析(O-PLS-DA)顯示了體內（橙色點）和體外（藍色點）產生的胚胎之間的兩種不同特征的明顯區分，交叉驗證的預測能力(Q2)為0.88，并且該模型由CV-Anova評估具有良好的可靠性，p值<0.0001（圖2B）。擬合模型包括314個特征，這意味著大多數已識別特征（314/496）參與解釋體內和體外產生的胚胎之間的脂質特征差異（補充表S2）。單變量分析突出了體內和體外對應物之間的105個顯著不同的特征（p<0.05和倍數變化<0.66或>1.5），包括50種注釋脂質（補充表S1）。在105個顯著特征中，27個的倍數變化大于2，表明體外產生的胚胎豐度增加，12個特征的倍數變化小于0.5，表明體外產生的胚胎豐度降低（表2）。在這105個顯著特征中，有10個在擬合模型中沒有發現，包括5種注釋脂質、2種脂肪酰胺、胡椒素和N-油酰GABA、1種氧化甘油磷脂、OHOHA-PC和2種三酰甘油、TG(16:0/16:1/16:1)和TG(46:0)。基于倍數變化和p值的火山圖突出了體外產生的胚胎的一般脂質富集，特別是在甘油三酯(TG)和氧化甘油磷脂(OHHdia-PS)中表現出大于40的倍數變化（圖2C）。相反，體內產生的胚胎富含甘油磷脂，特別是磷脂酰乙醇胺(PE)、絲氨酸 (PS)、甘油(PG)和肌醇(PI)。
圖2如下，(A)主成分分析圖(PCA)，代表根據主成分分析的體內和體外胚胎之間的差異。橙色點顯示體內來源胚胎的數據，藍色點顯示體外來源胚胎的數據。(B)通過正交偏最小二乘判別分析(O-PLS-DA)進行多變量分析，根據胚胎的脂質分布區分胚胎起源（體內與體外）。(C)基于倍數變化和p值的火山圖單變量分析，突出顯示幾種脂質。藍色和橙色點對應體外和體內產生的胚胎之間顯著不同的脂質。灰色點代表不重要的點。粉紅色圓點對應于具有顯著p值但倍數變化在0.66和1.5之間的脂質。該區域右側的所有脂質在體外胚胎都過多（藍點），而該區域左側的脂類在體內胚中過多（橙色點）。在p<0.05和倍數變化大于1.5或小于0.66時確定統計顯著性。顯著不同的注釋脂質在火山圖中由以下縮寫表示，磷脂酰乙醇胺 (PE)、肌醇 (PI)、絲氨酸 (PS)、甘油 (PG)、甘油三酯 (TG) 和氧化甘油磷脂 (OHHdia-PS 和 PKHdiA -PS）。
表2. 體外和體內胚之間差異表達的脂質
在該表中，在FC>1.5或<0.66的105種不同脂質中，僅顯示了39種最不同的脂質，此處顯示了具有FDR（錯誤發現率）的p值。補充表S1中提供了包含所有重要特征和脂質注釋的完整表格。
在慢速冷凍前后體內胚的脂質質譜特征：為了分析慢速冷凍過程對體內胚脂質譜的影響，使用了44個囊胚，分為兩組，一半的體內胚進行慢速冷凍。PCA顯示出區分體內新鮮（紅）和冷凍（綠）胚胎的趨勢（圖 3A）。多變量分析 (O-PLS-DA) 顯示新鮮和冷凍體內胚之間的兩種不同特征的明顯區分，交叉驗證的預測能力(Q2)為0.82，該模型由CV-Anova評估具有良好的可靠性，p值<0.0001（圖3B）。擬合模型包括162個參與解釋新鮮體內胚和冷凍胚之間脂質分布差異的特征（補充表 S2）。單變量分析突出了新鮮和冷凍體內產生的胚胎之間顯著不同的35個特征（p<0.05，FC<0.66或>1.5）（表3），包括20種注釋脂質（補充表S1）。在35個顯著特征中，19個表現出> 1.5的倍數變化，表明與新鮮胚胎相比，冷凍體內胚的豐度增加，和16個特征表現出的倍數變化< 0.66，表明與新鮮胚胎相比，冷凍體內胚的豐度降低（表3）。35個顯著特征中，有兩種未被發現，包括一種類二十烷酸、乙基-二乙酰氧基-6E、8E、10E、14Z-二十碳四烯酸酯和一種單酸甘油酯MG(22:5)。
火山圖體現了新鮮體內胚中溶血磷脂酰膽堿 (LPC) 過多，及冷凍胚中兩種甘油單酯 (MG) 和一種磷脂酰甘油 (PG) 過多（圖3C）。單變量分析還顯示LPC組成存在差異，尤其是LPC (18:2)，它僅存在于新鮮胚胎中，因此倍數變化等于0.00（表3）。
慢速冷凍前后體外胚的脂質譜特征：為分析慢速冷凍過程對體外胚脂質質譜的影響，使用了43個囊胚，其中冷凍了21個胚胎。PCA顯示體外鮮胚和冷凍胚之間存在重疊（圖4A）。多變量分析(O-PLS-DA)顯示兩個不同的特征，交叉驗證的預測能力(Q2)為0.82，并且該模型由CV-Anova評估具有良好的可靠性，p值< 0.0001（圖4B）。模型包括47個特征，這些特征參與解釋了體外鮮胚和冷凍胚之間的脂質特征差異（補充表S2）。單變量分析突出了新鮮和冷凍體外胚之間顯著不同的四種脂質（表4），其中三種注釋為LPC（補充表S1）。4個顯著特征都具有<0.66 的倍數變化，表明與新鮮胚胎相比，冷凍體外產生的胚胎豐度降低（表4）。火山圖表明了新鮮體外胚中LPC過多（圖4C）。
討論：
本文結果表明胚胎脂質譜主要受體外培養方案和慢速冷凍過程的影響，胚胎來源對脂質譜有非常大的影響，這意味著與母體生理環境相比，體外培養條件強烈改變了脂質代謝。實際上與體內胚相比，體外胚富含脂質，尤其是甘油三酯和氧化甘油磷脂。培養基的組成可以改變卵母細胞和胚胎中脂質的含量，尤其是加入血清時。Fergusson和Leese證明，在四細胞階段牛胚胎的培養基中添加10%的血清會導致甘油三酯水平顯著增加。在培養基中添加5%的胎牛血清也可以增加脂質含量，如棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸和硬脂酸。
大量的細胞內脂質會影響凍存過程后胚胎的復蘇和存活。減少這些脂質需要相當大的努力。在培養基中添加含有脂質的血清會導致卵母細胞成熟率和囊胚率降低，及凋亡細胞數量的增加。在沒有血清的情況下，會使受精卵從1細胞到4細胞的發育周期延長4-5小時，培養過程血清減少會使4細胞期胚胎的持續時間減少從而引發囊胚過早形成。因此，在使用合成血清替代品中可以找到一種解決方案。吩嗪乙基硫酸鹽與添加FCS產生的結果相似，同時減少了添加到培養基中的脂滴積累，提高了冷凍保存后的擴張和孵化率。
另一種解決方法是在胚胎培養的最后24小時內去除血清。去除血清刺激脂肪分解，導致游離脂肪酸增加，通過β-氧化消耗能量。添加脂解劑也可以降低細胞內脂質含量的水平。在脂解劑中，腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、毛喉素等通過直接作用于脂解途徑的成分來刺激細胞內脂解。與未補充脂解劑的胚胎相比，在玻璃化冷凍前48小時在胚胎的培養基中添加10μM毛喉素誘導脂肪分解，顯著提高了妊娠率（18.5%對48.8%）。
脂質過多與凍存效果降低之間的因果關系尚未完全確定。胚胎富含脂質會導致凍存的效果較低，但磷脂似乎對冷凍保存過程很重要。通過提高體外胚的磷脂含量，胚胎質量可能會提高。Banliat 等人已經證明在培養基中以0.05毫克蛋白質/毫升的濃度添加外泌體，培養7天后可使囊胚中的磷脂增加。
體內和體外胚中，鮮胚富含溶血磷脂酰膽堿，而在胚胎凍融后僅有少量的這種脂質。數據表明使用文中慢速冷凍方案，LPCs對冷凍保存高度敏感。LPC的這種高敏感性在人血漿、血清和尿液中沒有報道，在幾次冷凍(-20℃)/升溫循環后它們似乎保持穩定。LPC不僅對慢速冷凍敏感，對玻璃化冷凍也很敏感。事實上，小鼠卵母細胞在玻璃化冷凍后，溶血磷脂含量也降低了。LPC含量的這種降低有助于解釋移植后冷凍體外產生的胚胎的存活率、總細胞數和妊娠率的降低。單變量分析并未強調新鮮體內與體外胚中比較這種大量的LPC。盡管如此，體外產生的胚胎的LPC是體內胚胎的1.6倍。這可能是體外培養基造成的，因為血清中含有 LPA。LPA是小分子，通過Lats1/2激酶（大型腫瘤抑制因子1/2）的失活和YAP/TAZ磷酸化的減少來調節Hippo通路，這會誘導它們的核易位，且會通過增加CDX2的表達來促進細胞分化。如果觀察到的LPC減少與胚胎質量和存活率下降有關，未來的研究可能會集中在Hippo通路調節上以改善它。
該研究的獨創性在于能夠優先考慮影響胚胎脂質譜的因素。這樣，未來的研究應該集中在培養條件和冷凍方案上，以便它們對胚胎的脂質譜的影響較小。新穎之處還在于對胚胎進行了單獨分析，從而能夠獲得更精確的胚胎脂質譜并突出個體間的變異性。例如，防止溶血磷脂降解的冷凍介質可能有助于改進冷凍方案。但還需要進一步的研究來研究脂質與胚胎質量和冷凍保存敏感性之間的關系。
參考文獻：
Sarah Janati ldrissi,Daniel Le Bourhis,Antoine Lefevre,Patrick Emond,Laurene Le Berre,Olivier Desnoes,Thierry Joly,Samuel Buff,Virginie Maillard,Laurent Schibler,Pascal Salvetti& Sebastien Elis
“Lipid profle of bovine grade-1 blastocysts produced either in vivo or in vitro before and after slow freezing process” scientific reports，(2021)11:11618
天津力牧生物科技有限公司（簡稱“力牧生物”, www.f9755.cn ）成立于2016年，是一家專注于畜牧育種、遺傳改良、良種快繁的國家級高新技術企業。公司以分子育種、胚胎工程等動物高效育種、快速繁育技術為核心，聯合國內外知名研究機構產學研合作，發展現代畜牧種業。目前公司已在國內建立了遺傳性能優異的純血和牛、韓牛、西門塔爾牛、荷斯坦牛的核心群體，利用現代生物育種技術體系加快優良品種培育和快速繁育，以期為推動我國畜牧產業種質提升貢獻力量。
公司生物育種實驗室達到《檢測和校準實驗室能力的通用要求》及《檢測和校準實驗室能力認可準則》的要求，是國內率先獲得中國合格評定國家認可委員會（CNAS）實驗室能力認可證書的生物育種實驗室；公司已通過ISO9001質量管理體系認證，牛胚胎工程全流程實現標準化。
